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原文链接: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/imt2.70082

亮点

● 提出了“功能识别优先，靶向高通量分选”的新策略，实现了从经验驱动到数字驱动的范式革新，普适性强，应用前景广阔；

● 基于宏基因组数据构建数字细胞模型，精准预测目标菌株的碳源利用谱、营养需求和代谢特征，为选择性培养基的理性设计提供理论依据；

● 建立了厌氧微生物高通量挖掘→识别→培养→分选全流程，目标菌株获得率可达37%，菌株成活率＞70%，为合成微生物组产业化奠定关键菌株基础。

摘要

传统的厌氧微生物分选主要采用“先培养、后分选”策略，犹如“盲人摸象”，只能获得部分菌株。而且，功能菌株的获得普遍依赖人工分选，费时又费力。针对这一瓶颈，本研究创新性地提出了“功能识别优先、靶向高通量分选”新策略，能够快速、高效、全面的获得目标微生物。通过宏基因组测序和分箱技术分析，从12个规模化沼气工程样本中共识别到215个潜在的厌氧产氢功能菌株。基于宏基因组组装基因组（Metagenome-assembled genomes, MAGs）构建数字细胞模型，共确定了14种选择性培养基进行产氢菌的富集培养。采用流式细胞仪进行高通量分选，成功分选出81株潜在厌氧产氢菌株，目标菌株获得率可达37%，菌株成活率在70%以上。该方法实现了从经验驱动到数字驱动的范式革新，具备高度的通用性与可扩展性，可广泛应用于不同自然环境中的功能微生物挖掘与靶向分选，为合成微生物组产业化奠定重要的物质基础。

全文解读

引言

氢能被视为“未来的燃料”，是实现能源系统脱碳和应对全球气候变化的重要手段。然而，传统的天然混菌产氢体系常被称为“黑箱”，其不可控性和不稳定性导致底物利用不充分、氢气得率低及产氢速率受限等一系列问题，严重阻碍了其工业化应用进程。随着微生物组学、计算生物学、合成生物学等的快速发展，研究人员开始尝试通过整合不同微生物菌株，人工构建高效、稳定且可控的微生物群落——即人工合成微生物组，这一方向正迅速成为一个新的研究前沿。人工合成微生物组实现了“黑箱”趋于“白箱”化，可以灵活调控各代谢功能模块儿中的微生物，有望创造出生物制氢领域新的研究范式。值得注意地是，功能菌株是人工合成微生物组的物质基础。传统厌氧菌的分选方法（如滚管技术和平板划线）不仅操作繁琐、耗时耗力，且难以实现高通量分选。当前产氢功能菌株的分选主要采用“先培养后分选”策略，这对天然菌群中所含产氢菌的物种信息、营养物质和生长因子的需求了解有限，导致目标菌株的富集、培养与分选过程往往盲目而低效，犹如“盲人摸象”。缺乏针对性的培养基与培养条件设计，严重限制了产氢功能菌株的系统性获得。

为了突破传统分选方法的局限，本研究提出了“功能识别优先、靶向分选”新策略，并建立了厌氧产氢菌株挖掘、识别、培养、分选的高通量工作流程。首先，采用16S rRNA基因高通量测序和宏基因组学技术，对12个规模化沼气工程中潜在的厌氧产氢微生物进行了全面的挖掘和识别。然后，基于宏基因组组装基因组（Metagenome-assembled genomes, MAGs）的蛋白质序列，构建数字细胞模型，为产氢微生物选择性培养基的理性设计提供依据。最后，借助流式细胞仪实现高通量分选，快速、批量获得目标产氢菌株，为人工构建高效厌氧产氢微生物组奠定坚实的菌种资源基础。

结果与讨论

1.厌氧产氢微生物的挖掘

本研究采用16S rRNA基因高通量测序与宏基因组学技术，对来自12座大型沼气工程的样品进行系统性分析，以挖掘潜在的厌氧产氢微生物。在所有样本中共鉴定出16,262个扩增子序列变异（Amplicon sequence variants, ASVs）（图S1）。通过香农指数（Shannon index）评估微生物群落的α多样性（图1D），组间比较显示存在显著差异（Kruskal-Wallis H test，p < 0.05）。WT组的α多样性显著高于其余各组（p < 0.05），而JX组与CS组的多样性最低，且两组间无统计学差异（p > 0.05；图1D）。在β多样性方面，基于Bray-Curtis距离矩阵进行的非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling, NMDS）显示出样本组间明显的聚类模式（stress = 0.152；图1E）。

为了探究不同沼气工程中微生物群落的组成，我们分析了门和属水平上菌群的相对丰度。在门水平上，两种测序技术检测到的top10优势门差异较小，其中包含Firmicutes、 Bacteroidetes、Proteobacteria和Thermotogota四个具有潜在产氢微生物的菌门（图1F、G）。然而，在属水平上，两种测序技术检测到的top40优势菌属存在一定的差异（图1H、I）。值得注意的是，两种测序技术均检测到了具有潜在产氢微生物的菌属Bacteroides和Ruminiclostridium。此外，宏基因组技术还检测到了Clostridium菌属，凸显了其在挖掘功能性微生物方面的潜力。

为进一步深入探究潜在的厌氧产氢菌，我们对12个样本的宏基因组数据进行了序列组装与分箱处理，最终获得281个MAGs，其完成性均高于70%，污染率低于10%。这类高质量MAGs可用于推断功能类别、蛋白质结构域、代谢潜力等基因组特征。通过构建所有MAGs的系统发育树（图S2），可清晰呈现其进化关系；各MAG的完整性与污染率详见表S1。系统发育关系相近的MAGs往往表现出相似的营养需求与培养条件，这为靶向分离和培养先前未培养的微生物提供了新途径。

图1 实验流程与主要结果

（A）中国12个大型沼气工程样本示意图。 样本采集自不同沼气项目：YT（玉米秸秆，通化）、ML（木薯渣与秸秆，隆安）、NP（牛粪，平顶山）、NL（牛粪，凉山）、JB（鸡粪，重庆）、JX（鸡粪与餐厨垃圾，徐州）、CL（餐厨垃圾水解液，六安）、CS（餐厨垃圾，三明）、ZS（猪粪，遂宁）、WT（市政废水，天津）、YH（制药废水，黄冈）。（B）采用16S rRNA 基因高通量测序与宏基因组学分析全面挖掘并识别潜在厌氧产氢微生物。（C）产氢微生物的选择性富集培养及高通量分选。（D）α多样性香农指数（p < 0.05）。（E）微生物群落的β多样性分析：基于Bray-Curtis距离矩阵的细菌群落非度量多维尺度分析。（F）通过16S rRNA测序检测的门水平群落组成。（G）通过宏基因组学检测的门水平群落组成。（H）通过16S rRNA测序检测的属水平群落组成。（I）通过宏基因组学检测的属水平群落组成。（J）常见的厌氧产氢微生物。

2.产氢微生物的功能识别

基于宏基因组数据鉴定产氢相关功能基因，可以快速识别潜在的产氢微生物。厌氧发酵产氢过程中的核心代谢途径详见图2A。 甲酸裂解产氢、乙酸型发酵产氢和丁酸型发酵产氢是主要的厌氧发酵产氢途径，其相应的功能酶分别为甲酸裂解酶（FDH，EC：1.17.1.9）、乙酸激酶（AK，EC: 2.7.2.1）和丁酸激酶（BK，EC: 2.7.2.7）。此外，在产氢过程中，存在大量的竞争性代谢通路，产生大量的还原型产物，如丙酸、乙醇和乳酸等，会消耗大量的NADH，导致氢气得率降低。

本研究将具有功能酶（FDH、AK与BK）的MAGs视为潜在的厌氧发酵产氢微生物。通过韦恩图分析（图2B），从281个MAGs中识别出215个可能具备厌氧产氢功能的MAGs，其完成性均大于70%，污染率低于10%（图2C）。在这些MAGs中发现了117个高质量的MAGs （完成性> 95%，污染率<5%）。利用基因组分类数据库（GTDB）工具包对所有215个MAGs进行分类注释，其中209个MAGs属于细菌界，涵盖21个门，以厚壁菌门（Bacillota，原Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota，原Bacteroidetes）和假单胞菌门（Pseudomonadota，原Proteobacteria）为主。值得注意的是，目前已报道的大多数产氢细菌均隶属于这三个门（图1J）。其余6个MAGs属于古菌域中的广古菌门（Euryarchaeota）和盐杆菌门（Halobacterota）。尽管古菌也具有产氢相关的功能酶，但它们通常不作为主要的产氢微生物，因为大多数古菌将氢气作为产甲烷的中间代谢物[10]。此外，在脱硫和脱氮过程中也会产生氢气，但相关菌株并非以产氢为主要功能，因此不归类为产氢微生物。本研究进一步将215个具潜在厌氧产氢功能的MAGs与数据库进行比对，获取了相似性前五的物种信息（表S2），为理性设计选择性培养基提供了依据。

图2 产氢微生物的识别、选择性培养与高通量分选

1. 厌氧发酵产氢过程中的核心代谢途径。（B）基于甲酸脱氢酶（FDH）、乙酸激酶（AK）和丁酸激酶（BK）的功能基因筛选，通过韦恩图分析识别潜在厌氧产氢微生物。（C）利用CheckM筛选MAGs（完成性> 70%，污染率< 10%）。红色五角星标识高质量MAGs（完成性> 90%，污染率< 5%）。不同背景色区分所有MAGs在门水平上的分类；热图展示属水平分类及各MAG携带的产氢关键功能酶（EC: 1.17.1.9、EC: 2.7.2.1和EC: 2.7.2.7）；条形图显示各MAG的完成性与污染率。（D）部分潜在产氢微生物的碳源利用谱（包括多种糖类、有机酸、糖醇和氨基酸）。（E）流式细胞仪分选菌株在固体培养平板上的生长情况。

3.数字细胞模型指导选择性培养基的理性设计

基于宏基因组数据准确预测微生物的营养需求与代谢特性，进而实现菌株的定向培养与分离，仍是一项重大挑战。基因组尺度代谢网络模型（Genome-scale metabolic network models，GEMs）作为一种数字细胞模型，以数学形式表示单一生物体的代谢潜能。GEMs通过整合代谢网络相关的基因、反应及代谢物信息，能够系统解析底物利用谱、识别营养缺陷型表型，并精准预测菌株的最优生长速率。这为研究人员提供了一个定量框架来量化评估微生物如何利用资源进行生长，有效克服了传统培养方法的局限。

本研究对215个具有厌氧产氢潜力的MAGs 构建了GEMs模型，解析各MAG的底物利用谱和营养需求特征，进而指导选择性培养基的理性设计。GEMs全面预测了每个MAG所编码的全部代谢反应，明确了MAG在定义环境条件下对特定基质的利用、转化与交换模式。通过通量平衡分析方法，系统模拟了每个MAG分别在53种不同碳源培养基中的生长潜力（图S3与S4）。所选碳源包括多种糖类、有机酸、糖醇和氨基酸等，既涵盖生物质糖化液中的典型成分（如麦芽糖、纤维二糖、木糖和葡萄糖），也兼顾其普适性与代表性。模拟结果表明，在215个潜在厌氧产氢MAGs中，200个能够利用单一碳源生长，其余15个需依赖两种及以上碳源以维持正常生长（图2D展示了部分MAGs的碳源利用谱）。此外，我们还模拟了添加微量元素以促进营养缺陷菌的生长（图S5）。基于GEMs的模拟结果，共配制了14种选择性培养基（表S3）。

4.产氢微生物的高通量分选

本研究采用14种选择性培养基，对来自12个规模化沼气工程的样品进行了选择性富集培养。然后，通过流式细胞仪进行高通量分选，共分离获得81株潜在厌氧产氢菌株，覆盖11个门、48个属及66个种（表S4）。我们提出的“功能识别优先，靶向高通量分选”的新策略，目标菌株获得率达37%以上，菌株存活率超过70%（图2E）。成功分离的菌株包含产芽孢的严格厌氧菌（如Clostridium spp.）和不产芽孢严格厌氧菌（如Bacteroides spp.），证实了在流式细胞仪分选舱内构建局部厌氧环境的可行性与普适性。该方法不仅操作简便且经济实用。然而，当前的高通量分选技术主要依赖于单细胞分离原理，难以实现具有物理聚集特征和功能互作关系的微生物群落的同步分离。该局限已成为微生物分选领域的一个主要技术瓶颈（尤其在共生群落中），严重制约了微生物资源挖掘的效率。因此，开发新型分选技术仍面临重大挑战。

为突破这一限制，深入解析微生物种间相互作用机制至关重要。代谢生态位重叠程度可作为资源利用相似性的指标，来预测菌株间的竞争潜力，但其无法阐释由资源分配、交叉喂养、资源获取策略的差异或进化合作等引发的积极生态相互作用。如果将GEMs模型与生态位重叠预测相结合，为预测微生物间相互作用提供了一种强有力的手段，为同时培养和筛选相互作用的菌株奠定了坚实基础。在高通量分选技术方面，液滴微流控等新兴分选平台展示出重要潜力。该技术可实现目标微生物聚集体与必需营养物质共包裹于油包水（W/O）液滴中，形成适于原位培养与分选的功能性微单元，为挖掘和分选先前未培养或难以培养的功能性微生物群落开辟了新的途径。

结论

本研究在厌氧产氢微生物的高通量分选方面取得了重要进展。宏基因组数据提供了丰富的物种信息，对于挖掘和识别潜在产氢菌株至关重要。基于MAG构建数字细胞模型，模拟预测目标功能菌株的碳源利用谱、营养需求和代谢特征，可有效指导选择性培养基的理性设计。我们提出了一种“功能识别优先，靶向高通量分选”的新策略，该策略能够全面、快速、高效地获取目标菌株，为从不同自然环境中挖掘和分选功能性微生物提供了一种普适性强且高效的方法。这为利用“未培养”微生物提供了全新范式，助力人工合成微生物组的工业化应用进程。

Jianfeng Liu, Wei Xing, Xingyang Zhang, Nengyao Xu, Ran Xu, Junsha Gong, Jia Zhang, et al. 2025. Metagenomics and Digital Cell Modeling Facilitate Targeted High‐Throughput Sorting of Anaerobic Hydrogen‐Producing Microorganisms.iMeta 4: e70082. 

https://doi.org/10.1002/imt2.70082.